Genomszerkesztés és jövő

Bevezetés
A DNS felfedezése óta számos technológia fejlődött ki a szervezetek genetikai manipulálására a jobb mezőgazdasági és ipari alkalmazások érdekében. A következő generációs szekvenálási technikák megkönnyítették a különböző gének és mutációk azonosítását a DNS-ben. A már régóta használatban lévő GMO-k és klónozási technikák az ezen a területen elért fejlődés közvetlen eredményei. Ezeket a klónozási technikákat orvosi, mezőgazdasági, ipari és kutatási alkalmazások széles körében használták az elmúlt évtizedekben. Azonban minden fejlődés és haladás ellenére folyamatosan szükség van fejlettebb génszerkesztési technikákra, amelyek pontosak és pontosak. A programozható nukleázok genetikai módosításokhoz való felhasználása az elmúlt évtizedben megnövekedett, mivel számos öröklődő betegségek és rák kezelésére alkalmas. Az elmúlt évtizedben a programozható nukleázok három fő osztálya került napvilágra: a cink ujj nukleázok (ZFN), a transzkripciós aktivátor-szerű effektor nukleázok (TALEN) és a klaszterezett, szabályosan elhelyezkedő rövid palindrom ismétlődések (CRISPR) – kapcsolódó Cas9 (CRISPR/Cas9). .

Cink ujj nukleázok (ZFN)
A ZFN-ek voltak a legkorábban kifejlesztett genomszerkesztő eszközök, amelyek nagyobb pontossággal képesek megváltoztatni a genetikai tartalmat. A ZFN-ek két doménből állnak, ismétlődő cinkujj fehérjékből (ZFP), amelyek DNS-kötő doménjei egy FokI restrikciós endonukleáz nem specifikus DNS hasítási doménjéhez fuzionálva vannak. A ZFN-ek dimerként működnek, ahol minden monomer egység képes 18-XNUMX bázispár (bps) DNS felismerésére a cink-ujj DNS-kötő doménjén keresztül. A cink ujj domének széles skálája létezik, amelyek felismerik a különböző DNS-hármasokat. Ezeket összekapcsolva polidaktil-cink-ujj fehérjéket állíthatunk elő, amelyek a lehetséges DNS-szekvenciák széles skáláját célozhatják meg. Azonban a célon kívüli szerkesztés/mutációk jelentik a fő gondot a ZFN-alapú génszerkesztéssel kapcsolatban. Ezért bőven van lehetőség ennek a folyamatnak a hatékonyságának növelésére.

Transzkripciós aktivátor-szerű effektor nukleázok (TALEN)
A TALEN a ZFN-ek alternatívájaként jelent meg a genomszerkesztéshez. A ZFN-ekhez hasonlóan a TALEN-ek két programozható DNS-kötő domént tartalmaznak, amelyek egy FokI endonukleáz doménhez vannak fuzionálva, és a kettős szálú törések (DSB) bevezetésével működnek. A transzkripciós aktivátor-szerű effektorokat (TALE) természetesen a Xanthomonas spp. baktériumok, amelyek a gazdaszervezet DNS-éhez kötődnek. A TALE DNS-kötő domén több ismétlődésből áll, amelyek 33-35 aminosavból állnak, és mindegyik ismétlődés egyetlen nukleotidot ismer fel. A TALE DNS-kötő domén specifitása a hipervariábilis régiók jelenlétének köszönhető az egyes doménekben a 12. és 13. aminosav pozícióban. Ezért a szekvencia-specifikus TALEN-eket úgy lehet előállítani, hogy ezeket az aminosavakat módosítjuk a hipervariábilis régiókban, és összekapcsoljuk a különböző TALE ismétlődéseket.

Clusterált, szabályosan interspaced short palindromikus ismétlődések (CRISPR) – asszociált Cas9 (CRISPR/Cas9)
A ZFN-ek és TALEN-ek mellett a CRISPR/Cas9 egy másik gyorsan fejlődő génszerkesztő eszköz. Ez egy természetesen előforduló bakteriális rendszer, amely a bakteriális adaptív immunitás összetevőjeként működik. Védelmet nyújt a baktériumok számára a behatoló vírusok és plazmidok ellen az RNS által irányított DNS-hasítás révén Cas-fehérje által. A CRISPR/Cas9 rendszernek három fő összetevője van: a CRISPR RNS (crRNS), a transzaktiváló crRNS (tracrRNS) és a Cas9 enzim. A crRNS átíródik a behatoló rendszerből, protospacer szekvenciaként ismert, és hibridizálódik a tracrRNS-sel, amely kiváltja a Cas9 nukleáz kötődését a DNS hasítási helyéhez, és bázisként működik. Ellentétben a ZFN-ekkel és a TALEN-rendszerekkel, amelyek az adott genomszekvencia specifikus szekvenciáit különböző felismerő fehérjék segítségével ismerik fel, a CRISPR/Cas rendszer a célgenomi szekvenciával komplementer RNS-szekvenciát használja. Az RNS hibridizáció előnye a helyspecifikus hasításban kiméra „guide” RNS (gRNS) alkalmazását váltja ki a genomiális szerkesztéshez, amely a crRNS és a tracrRNS összeolvadásával jön létre. A gRNS 20 nukleotid vezérszekvenciát tartalmaz, amelyeket specifikus DNS-szekvenciákhoz való kötődésre terveztek. Ezért a gRNS és a Cas9 képesek beolvasni a megfelelő helyet, és ahhoz kötődni, hogy helyspecifikus kettősszál-töréseket (DSB) hozzanak létre. Így a CRISPR/Cas9 rendszer a korábbi technikákhoz képest viszonylag pontosabb génszerkesztési technikát kínál, és sokféle alkalmazáshoz használható.

Következtetés
Egyelőre nyilvánvaló, hogy a jelenlegi génszerkesztési mechanizmusok pontosabbak és széles körben alkalmazhatók anélkül, hogy nagyobb etikai és fiziológiai vonatkozásaik lennének. Ezért elkerülhetetlenek a nagyobb pénzügyi előnyök és a folyamatos fejlesztések ezen a területen. A racionális kutatás-fejlesztés, a célpontok megfelelő azonosítása és a szellemi tulajdon védelme szintén fontos a következő generációs terápiák, biológiai termékek és eljárások fejlesztésében.